¿Cómo hacemos en el laboratorio para estudiar un biofilm bacteriano?
Soy Andrea, y actualmente estoy haciendo mi Trabajo de Fin de Grado en el Área de Microbiología.
En este vídeo os vamos a enseñar tres métodos que utilizamos en el laboratorio para caracterizar el biofilm de nuestra bacteria favorita:
Pseudomonas putida. Pseudomonas putida es una bacteria que tiene un gran interés,
tanto industrial como medioambiental, ya que es capaz de degradar un gran número de compuestos tóxicos.
Además es muy fácil de manipular genéticamente. Putida, al igual que la mayoría de bacterias, es capaz de formar biofilms, que son comunidades microbianas muy bien estructuradas
que se encuentran embebidas en una matriz, la cual está formada por una gran cantidad de sustancias que segregan las propias bacterias. Además,
estas comunidades se desarrollan siempre sobre una superficie.
Cuando las bacterias viven en estas comunidades, se comportan muy diferente a cuando lo hacen
en forma de células individuales, ya que hay muchos genes que se quedan silenciados
y otros muchos que se activan. En genética, tenemos un truco para ver qué gen es importante
para cada función en un organismo. Es truco consiste en eliminar el gen y ver qué sucede.
A estos organismos modificados, los llamamos “mutantes”.
La manera más sencilla de determinar si una bacteria produce biofilm o no, es poniéndola
en contacto con una superficie. En este primer ensayo, lo que vamos a hacer es crecer un
cultivo líquido de Pseudomonas putida. Lo vamos a incubar durante 24 horas a una temperatura
de 30 ºC, que es su temperatura óptima de crecimiento, y en agitación para que el oxígeno
se distribuya de forma correcta. Como podemos observar, el cultivo está turbio,
lo que significa que nuestra bacteria ha crecido bien.
En las paredes del tubo de ensayo, se ve cómo se ha adherido una especie de anillo sólido.
Ese es el biofilm que se genera. En estos otros dos tubos, podemos ver el comportamiento
de dos mutantes: uno que superproduce biofilm, y otro que no es capaz de generarlo.
Hola, soy Elisa, alumna interna del Área de Microbiología. Como os ha mencionado antes
mi compañera, los biofilms no son simples batiburrillos de células, sino que son estructuras
altamente organizadas. Esta organización 3D se consigue gracias a la matriz extracelular.
Esta matriz no es más que un conjunto de sustancias que secretan las bacterias, generalmente
polímeros. Podemos dividir estos polímeros en 4 grandes grupos: polisacáridos o azúcares
complejos, como son la celulosa y el alginato; proteínas; ácidos nucleicos, como el ADN;
y en algunas ocasiones, lípidos o grasas. Toda esta estructura de compuestos forma canales
por los que circula el agua con nutrientes y sustancias de desecho que mantienen conectadas
a las bacterias dentro del biofilm. Además, esta estructura les confiere gran resistencia
a condiciones ambientales adversas y también a antibióticos, ya que éstos no pueden acceder
tan fácilmente a las bacterias del biofilm. En este ensayo vamos a teñir los polisacáridos
del biofilm de Pseudomonas putida con Rojo Congo. El Rojo Congo es un colorante que se
une a la celulosa y a polisacáridos con estructura parecida a ésta.
Para ello, hemos preparado placas de Petri con el medio de cultivo al que le hemos añadido
este colorante. A continuación, pondremos sobre la placa gotas de cultivo saturado de
nuestra bacteria. Y las dejamos secar. Finalmente, la ponemos a incubar en la estufa a 30ºC
durante 48 horas. A los 2 días, ya podemos apreciar cómo el
Rojo Congo ha teñido nuestro biofilm. En este cultivo de Pseudomonas putida, la colonia
ha ido adquiriendo un color rojo oscuro. En un mutante que superproduce biofilm, podemos
ver cómo además forma unas estrías muy bien marcadas, indicadoras de que ha producido
gran cantidad de polisacáridos. Por último, en este otro mutante, que, aunque también
superproduce biofilm, no es capaz de producir celulosa, vemos que se forman muchas menos
estrías.
En su ciclo de vida, las bacterias van alternando entre un estilo de vida libre y un estilo
de vida en comunidad. Entonces, ¿cómo deciden cuándo formar un biofilm y cuando dejar de
formar parte de él? Soy Marta, investigadora predoctoral FPU en el Área de Microbiología.
En su etapa de vida móvil, también denominada planctónica, cuando una bacteria alcanza
una superficie con condiciones de crecimiento favorables, puede asentarse sobre ella y reproducirse.
Entonces, si la tiene, puede perder esa cola que utilizaba para desplazarse, a la que denominamos
“flagelo”. Además, comienzan a sintetizar unas proteínas
llamadas “adhesinas” que son fundamentales para quedarse pegadas tanto al sustrato, como
a otras bacterias. También generan los componentes de la matriz extracelular, y entonces proliferan
dando lugar a microcolonias hasta llegar a formar un biofilm maduro.
Ante un estímulo ambiental, como puede ser la falta de nutrientes, las bacterias pueden
decidir si huir de ese ambiente hostil, recuperando su flagelo. Entonces es cuando ocurre la dispersión
del biofilm y vuelta al estado de vida planctónico. En el laboratorio podemos recapitular todas
estas etapas del desarrollo de un biofilm aprovechando la curva de crecimiento bacteriano.
En esta placa hemos crecido un cultivo líquido de Pseudomonas putida, representado en cada
columna, cada una de estas fases de crecimiento.
En la fase de latencia, las bacterias tienen que adaptarse a las condiciones de cultivo.
Entonces comienzan a dividirse de manera exponencial hasta que van agotando los nutrientes del
medio,
entrando así en fase estacionaria, y muriendo con el tiempo.
Putida es capaz de formar biofilm en las paredes de los pocillos de este tipo de placas.
Para poder verlo, tenemos que retirar primero todas las células planctónicas, lavando
con agua. A continuación, teñiremos las bacterias que quedan con cristal violeta.
Retiramos el colorante que nos sobra.
Como vemos, sólo quedan teñidas las células del biofilm.
Finalmente, solubilizaremos el tinte con alcohol.
Conforme las células empiezan a dividirse, van formando biofilm en las paredes de los
pocillos. Cuando llegan a fase estacionaria, se quedan sin nutrientes en el medio, y lo
dispersan. En estas otras dos placas hemos crecido dos
mutantes diferentes: uno que es capaz de formar mucho menos biofilm, y otro que, aunque es
capaz de formarlo, no lo puede dispersar. Al final va a resultar que las bacterias no
son unos bichos tan simples como nos creíamos. Esperamos que os hayan gustado estos vídeos.